目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產(chǎn)，無論采用什么機(jī)器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的。申能*公司采用的合成儀主要機(jī)型為ABI3900高通量合成儀，合成長鏈主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成儀，引物修飾和高OD數(shù)合成采用ABI394等。

亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。

*步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯yi酸反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5'-羥基；

第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷ya磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。

第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用yi 酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時分離掉。

第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。

經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯yi酸脫去它的5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。